ЛАКТОБАЦИЛИ (LACTOBACILLUS) В МІКРОФЛОРІ ПІХВИ ЗДОРОВИХ ЖІНОК, В ПЕРШОМУ ТРИМЕСТРІ ВАГІТНОСТІ

Г. Кісс,а Б. Коглер,б Л. Петрицевіц, а І. Сауерзапф, б С. Клайраунг, в К. Доміг, б Г. Вірнштайн, в В. Кнайфель

 Відділення акушерства та гінекології, Віденський медичний університет і медична школа, Відень, Австрія б Відділення харчової мікробіології і гігієни, кафедра харчових наук та технологій, Університет природних ресурсів та прикладних біологічних наук, Відень, Австрія в Кафедра фармацевтичної технології і біофармацевтики, Віденський університет, Відень, Австрія.

Адреса для кореспонденції: Dr. H Kiss, Medical University of Vienna, Department of Obstetrics and Gynaecology, AKH-Wien, Wahringer Guertel 18-20, A-1090 Vienna, Austria.

E-mail: Herbert.kiss@meduniwien.ac.at

Затверджено 19 березня 2007 р Опубліковано OnlineEarly 18 вересня 2007 р.

Мета. Дослідження було проведено з метою охарактеризувати домінантні види лактобацил, які колонізують піхву здорових вагітних жінок.

Тип. Описове перспективне групове дослідження.

Місце проведення. Відділення акушерства та гінекології, Віденський медичний університет і медична школа, Відень, Австрія.

Піддослідні. У дослідженні взяли участь 200 жінок, що знаходяться в кінці першого триместру вагітності без клінічних ознак бактеріального вагінозу. Нормальні показники флори піхви були виявлені у 126 з 200 випробовуваних жінок (ґрунтуючись на методі забарвлення по Граму).

Методи. Проби культур бактерій, узятих у 126 жінок, були піддані подальшій обробці щодо виявлення видів лактобацил. У загальній сумі у 84 жінок 168 колоній були виявлені мікроорганізми роду лактобацил (Lactobacillus). Ґрунтуючись на комбінованих результатах мікробіологічних методів і множинного видоспецифічного ПЛР-аналізу для визначення родової приналежності, лактобацили були виділені з піхви 72 жінок.

Основні вихідні показники. Ідентифікація видів лактобацил флори піхви у здорових вагітних жінок.

Результати. Видами, що найбільш часто зустрічаються виявилися Lactobacillus crispatus та Lactobacillus gasseri, за якими слідують Lactobacillus jensenii та Lactobacillus rhamnosus.

Висновки. Отримані результати стали підставою для створення унікального комплексу лактобактерій, що містить L.crispatus, L.gasseri, L.jensenii, L.rhamnosus в кількості 100 х 10⁹ КУО/г кожної, призначеного для лікування і профілактики бактеріального вагінозу. На фармацевтичному ринку Європи цей комплекс має назву Астарті (www.astarte-probiotics.com), в Україні – Флоріум (www.anantamedicare.com).

Ключові слова. Ідентифікація, Lactobacillus, вагітність, піхва.

Посилання на дану роботу: Kiss H., Kogler B., Petricevic L., Sauerzapf I., Klayraung S., Domig K., Viernstein H., Kneifel W. Vaginal Lactobacillus microbiota of healthy women in the late first trimester of pregnancy. BJOG 2007;114:1402-1407.

Вступ

У піхві здорової жінки у великій кількості присутні різноманітні види лактобацил, які відіграють важливу роль у захисті від генітальних інфекцій. У період вагітності особливо важливим є природний і здоровий баланс флори в піхві, оскільки вагінальна інфекція може призвести до передчасних пологів. Недолік лактобацил може порушити баланс мікрофлори в піхві, що в свою чергу нерідко призводить до появи синдрому бактеріального вагінозу^2,3,  який пов'язаний з кількісними і якісними змінами флори піхви: зменшенням кількості лактобацил і різким збільшенням кількості анаеробних бактерій.4 За Ньюджентом та ін. бактерійний вагіноз характеризується абсолютним зниженням кількості лактобацил і одночасним збільшенням кількості грамваріабельних і грамнегативних паличок, в першу чергу, таких як Gardnerella vaginalis, а також Bacteroides, Prevotella і Mobiluncus.2,3 Проте, зменшення кількості лактобацил в піхві також наражає на ризик інфікування невагітних жінок, що може привести до ендометриту або навіть запаленню органів малого таза.6,7

Відзначено, що різні види лактобацил в різних кількостях присутні в піхві. Вони відрізняються швидкістю зростання і виробляють або молочну кислоту, або пероксид водню.8 На цей час виявлено такі види лактобактерій: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus vaginalis та Lactobacillus salivarius.

ª  2007 The Authors  Journal compilation ª  RCOG 2007  BJOG An International Journal of Obstetrics and Gynaecology

 У нещодавно проведеному і опублікованому дослідженні з вивчення лактобактеріальной флори піхви Васкес та ін. виявили, що у флорі піхви у більшості досліджуваних пацієнтко домінували лактобацили одного типу з наявністю також інших видів, що вказує на широку індивідуальну варіабельність. Видами, що  найчастіше зустрічаються виявилися: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners та L. jensenii. В іншому дослідженні, проведеному вченим Рейдом і ін., найбільш часто виділяються наступні види лактобацил L. jensenii, L. acidophilus, L. casei та L. gasseri. Цілком зрозуміло, що існує значна географічна мінливість в складі нормальної лактобактеріальной флори піхви.

Дане дослідження було проведено з метою охарактеризувати домінантні види лактобацил, які колонізують піхву здорової вагітної жінки, для того, аби вивчити деякі з їх фенотипічних і генотипових властивостей, а також отримати краще уявлення про потенційну роль цих видів, яка може бути асоційована зі статусом «неінфікованість».

Матеріали та методи

Проведення цього дослідження було схвалено комітетом з етики Віденського медичного університету. У дослідженні взяли участь жінки зі строком вагітності від 11 до 14 тижнів, які планували народжувати у відділенні акушерства і гінекології Віденського медичного університету. Умовою для допущення до участі в дослідженні була відсутність суб'єктивних скарг, вагінальної кровотечі, клінічних ознак вагінальної інфекції, а також за умови діагностованої нормальної флори піхви. Всі підготовлені матеріали піддавалися забарвленню по Граму і оцінювалися за системою Ньюджента.

Зразки бактеріологічного посіву, взятих у жінок, вагінальна флора яких була класифікована як нормальна (число балів за Ньюджентом 0-3) і в яких не було виявлено колонізації Candida (суперечки і гіфи), були поміщені в транспортну середу і передані до Віденського університету природних ресурсів і прикладних біологічних наук для подальшої обробки і видової належності лактобацил, використовуючи фенотипічні і генотипические методи. Огляд аналітичних методів представлений на Рис. 1.

Всі колонії, отримані на агарових пластинах, були обстежені макроскопічно і після цього знезаражені, за винятком бактеріальних ізолятів, зібраних з МРШ агару.

Для проведення ДНК досліджень кожен ізолят лактобацили був попередньо вирощений в живильному середовищі мрш, за умови інкубації в анаеробних умовах протягом 24 годин при 37 ° С; 1,5 мл даної бактеріальної культури центрифугировали (5415 R; Eppendorf, Гамбург, Німеччина) протягом 7 хвилин при 4 ° С (5900 g). Осад був перерозчинений в 900 мкл стерильному розчині хлористого натрію (0,9%), перемішаний і знову піддавався центрифугуванню. Після цього видалили надосадову рідину і повторили стадію відмивання.

Колонії, які були визначені за допомогою ПЛР як ті, що відносяться до роду лактобацил, і всі типи штамів були оцінені із застосуванням методу множинної ПЛР, як описано в роботі Сонг та ін. (Song et al)^12,13.

RAPD аналіз (довільно ампліфікована поліморфна ДНК) проводився з переважаючими видами лактобацил, які були виявлені в ході дослідження.

Результати

У період з січня по квітень 2005 року в даному дослідженні взяли участь 200 вагітних жінок. Вік досліджуваних пацієнток був в межах від 18 до 35 років. У загальній сумі у 126 жінок була діагностована нормальна флора піхви (за методом Nugent et al.⁵), також відсутність колоній грибка Candida.

З 72 жінок, у яких методом видоспецифічною ПЛР були виявлені лактобацили, у 19 (26,4%) жінок флора піхви була колонізована тільки L. gasseri та у 17 (23,6%) - тільки L. crispatus. У трьох жінок (4,2%) разом співіснували ці обидва види лактобацил. Загалом, у піхві 10 з 72 жінок в один і той же час були виявлені мінімум 2 різних види Lactobacillus. Детальні результати представлені в табл. 1.

У 126 колоніях Lactobacillus, виділених у 72 жінок, виявлені 8 різних видів лактобацил, які, в свою чергу, домінували в мікрофлорі піхви. З них найбільш часто зустрічаються L. crispatus та L. gasseri, виявлені в 20% та 18% з 126 колоній Lactobacillus. L. acidophilus, L. plantarum та L. salivarius не були виділені ні з однієї колонії. Докладні результати підсумовані в табл. 2. 

Хоча в рамках проведення дослідження не входила повна реєстрація всіх видів бактерій, виявлених у вагінальних мазках, крім молочнокислих, були також виділені інші види бактерій, використовуючи селективні методи, методи мікроскопічної і макроскопічної ідентифікації, а також забарвлення по Граму. Результати дослідження зразків вагінальної флори, виділених у 126 вагітних жінок, підсумовані в табл. 2. У вагінальній флорі переважали лактобацили. У піхві 40 з 126 жінок (31%) домінантними колоніями бактерій були не лактобацили, а у 23 з 126 жінок (18%) були виявлені як лактобацили, так і грамнегативні палички. На тлі домінуючих лактобактерій, інші мікроорганізми, такі як кишкові палички, Gardnerella і дріжджові гриби, були представлені більш низькою щільністю популяції. Було навіть менш ймовірно виділити Escherichia coli у жінок, у яких були знайдені L. crispatus або L. gasseri.

Рис. 4 Агарозний гель з RAPD продуктами, отриманими із зразків, узятих у жінок, піхва яких була колонізована більш ніж однією колонією L. crispatus. Стовпець М, молекулярний маркер (в п. Н.); стовпці 1-9 відображають групи штамів L. crispatus, які мають певну відмінність, але виявляють тісний взаємозв'язок. Ідентифіковані різні RAPD типи

Види лактобактерій або комбінації видів

Candida albicans була виявлена у 12 жінок. Виражений взаємозв'язок між наявністю або відсутністю лактобацил і зростанням C. albicans встановлено не було.

Домінантні види Lactobacillus, виділені при проведенні видоспецифічної ПЛР, (а саме: L. crispatus, L. gasseri і L. jensenii) використовувалися для отримання генетичних «відбитків пальців». Зразки, взяті з піхв жінок, колонізованих більш ніж однієї колонією одного і того ж виду Lactobacillus, потім були досліджені методом RAPD-ПЛР. У випадку з L. crispatus, були досліджені 20 зразків, узятих у 9 жінок. (Рис. 4).

Жінки / Ізоляти

У випадку з L. gasseri були вивчені 23 колонії, які були виділені у 9 жінок. Генетичні «відбитки пальців», отримані при проведенні RAPD-ПЛР, використовуючи зразки, взяті у однієї жінки, трохи відрізнялися один від одного, але проявляли тісний взаємозв'язок. З 19 зразків було виявлено максимум 3 RAPD типу.

Обговорення

Раніше вважалося, що у мікрофлорі піхви здорової жінки дітородного віку переважають бактерії L. acidophilus та L. fermentum, після яких по частоті слідують L. brevis, L. jensenii, L. casei з усіма підгрупами,¹⁰ а також інші види лактобацил.

Пізніше молекулярні методи показали, що найбільш поширеними ізолятів є L. crispatus, L. jensenii і L. iners.^10,19 За результатами нашого дослідження виявилось, що в піхві вагітних жінок найбільш частіше зустрічаються види L. crispatus і L. gasseri лактобацил, за якими йдуть L. jensenii і L. rhamnosus (рис. 3). Якщо говорити більш конкретно, у флорі піхви всіх 72 учасниць, у яких лактобацили піддавалися культивування, домінував або один вид, або комбінація з двох видів лактобацил. На відміну від опублікованих раніше результатів,¹⁰ бактерія L. acidophilus була слабо представлена в нашому дослідженні. Однак ці результати відповідають результатам робіт Васкеса (Vasquez et al.⁹) та Антоніо (Antonio et al.²⁰), в яких було встановлено, що L. jensenii, L. crispatus і L. gaseeri є домінуючими видами Lactobacillus в піхві.

Існує декілька можливих причин, що пояснюють суперечливість вже наявних даних по вагінальній флорі Lactobacillus, описаних в різних дослідженнях. Такі фактори, як стан здоров'я носія, вагітність, вік або географічні умови можуть впливати на мікрофлору піхви. Результати, отримані за допомогою проведення видоспецифічної ПЛР, відповідають результатам роботи Васкеса (Vasquez et al.⁹), вказуючи тим самим на те, що L. crispatus, L. gasseri і L. jensenii можна вважати переважаючими видами лактобацил в піхві. Наші дані повністю відповідають попереднім даним досліджень Васкеса (Vasquez et al.⁹), який використовував RAPD аналіз та множинну ПЛР для ідентифікації вагінальної флори Lactobacillus. У своїй роботі Антоніо (Antonio et al.²⁰) також ідентифікував ці види на основі полнохромосомних ДНК-зондів. Таким чином, застосування генотипічниих методів є зручним способом для класифікації і диференціації видів вагінальних лактобацил.

Лактобацили були виявлені у 84 (67%) з 126 жінок, чиї зразки вагінальної флори були взяті для характеристики (рис. 1).

Так як наша вибірка пацієнтів складалася зі здорових жінок, що знаходяться на початку першого триместру вагітності, ймовірно, що виявлений нами розподіл лактобацил відповідає такому у невагітних жінок в цілому. У клінічній практиці отримані нами дані можуть мати велике значення, як для замісної терапії, так і для діагностики бактеріального вагінозу.

 Відмінною рисою бактеріального вагінозу є зменшення числа або відсутність лактобацил у вагінальній мікрофлорі, а також надмірний ріст анаеробних і факультативно-анаеробних організмів.  Анти-

біотікотерапія, хоча і зменшує концентрацію патогенних бактерій, які є причиною появи симптомів бактеріального вагінозу, але також під її вплив потрапляють корисні лактобацили, що з часом призводить до пригнічення вже виснаженої на той момент флори Lactobacillus. Отримані нами дані вказують на те, що заміщення або L. crispatus і L. gasseri, або L. jensenii і L. rhamnosus може бути більш ефективними в питанні відновлення нормальної вагінальної флори Lactobacillus і уникнення рецидиву інфекції, ставлячи під сумнів значення вагінальних терапевтичних засобів, що містять інші види лактобацил. Пробіотичні добавки були запропоновані в якості альтернативного методу підтримки і відновлення здорової вагінальної флори.²¹ В даному контексті отримані нами дані будуть дуже корисними при подальшій розробці пробіотиків, призначених для підтримки жіночого здоров'я.

Отримані результати стали підставою для створення унікального комплексу лактобактерій, що містить L.crispatus, L.rhamnosus, L.gasseri, L.jensenii в кількості 100 х 10⁹ КУО/г кожної, призначеного для лікування і профілаткікі бактеріального вагінозу. На фармацевтичному ринку Європи цей комплекс має назву Астарті (www.astarte-probiotics.com), в Україні - Флоріум (www.anantamedicare.com).